SWITCH:基于CRISPR的酿酒酵母途径基因整合及优化体系

上海工业生物技术研发中心 2017/9/19 11:11:07
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基于CRISPR-Cas免疫系统的基因组编辑技术自2013年问世以来,立刻掀起了一场该领域的革命。酿酒酵母作为广泛应用的有着重要工业和学术价值的真核模式生物,也开发了基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术。近日,来自丹麦的科学家在Microbial Cell Factory 杂志撰文,阐述一种基于CRISPR-Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑技术新应用。

该方法被命名为SWITCH,顾名思义,即对酵母的状态进行人为的转换。该方法简要分为4步:1、在酿酒酵母基因组特定位点整合Cas9表达蛋白;2、Cas9介导的酵母基因组编辑,包括敲除、整合等;3、Cas9蛋白替换为dCas9 或者dCas9 调节因子;4、对特定代谢途径(往往是第2步新整合的)进行调节。

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图1 SWITCH流程 

具体而言,研究人员在之前鉴定过的无不利影响的位点整合了Cas9表达蛋白,URA3 marker筛选阳性转化子,该marker侧翼有重复序列,经过多轮传代marker环出回收。这样就完成了第1步操作,使菌株进入了一种可被编辑的状态。接下来研究人员在基因组上另外位点依赖DNA assembler技术整合了5基因的柚皮素合成途径,使用筛选过的gRNA,阳性率很高。关键的第3步,是将基因组上整合的Cas9蛋白替换为dCas9 vp64激活子。同样在筛选的gRNA下,替换成功率达到100%。最后作者探究了激活子对途径基因的激活能力,利用real-time PCR检测发现基因表达量均有不同程度的提高。

以上SWITCH技术的建立,可以说在酵母体内建立了一整套比较完整的途径整合、优化策略,可以理解为将之前大家做的零散工作打包整理。

摘译自:https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0632-x  


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